Project R-1058

Titel

De rol van HLA-E gerestricteerde CD8+ regulatoire T-cellen in multiple sclerose

Abstract

Multiple sclerose is een inflammatoire aandoening van het centrale zenuwstelsel waarbij autoreactieve T-cellen een belangrijke rol spelen. Deze autoreactieve T-cellen komen echter ook bij gezonde personen voor maar leiden hier niet automatisch tot auto-immune aandoeningen. Er bestaan namelijk diverse mechanismen waardoor deze autoreactieve T-cellen onderdrukt worden. Recente studies hebben aangetoond dat regulatoire T-cellen (Treg) hierbij een belangrijke rol spelen. Deze regulatoire T-cellen kunnen onderverdeeld worden in twee groepen: de natuurlijk voorkomende Treg en de induceerbare Treg. Tot deze laatste groep behoren de murine Qa-1 gerestricteerde CD8+ T-cellen. EAE, een diermodel voor MS, toonde aan dat deze een antigen herkennen gebonden aan Qa-1, dat tot expressie gebracht wordt op autoreactieve T-cellen. Herkenning leidt tot de onderdrukking van de autoreactieve T-cellen. Gegevens over de humane variant, HLA-E gerestricteerde CD8+ T-cellen, in multiple sclerose zijn echter beperkt. Daarom is een grondige karakterisatie van deze regulatoire T-cellen noodzakelijk om hun rol in het ziekteproces beter te begrijpen. Detectie en isolatie van HLA-E gerestricteerde CD8+ Tregs wordt op twee manieren uitgevoerd. Enerzijds via een directe ex vivo analyse zonder bijkomende manipulaties, anderzijds worden CD8+ T-cellen in vitro opgegroeid wat toelaat om meer te weten te komen over hun effectorfunctie en -mechanisme. Voor de ex vivo analyse worden HLA-E gerestricteerde CD8+ T-cellen aangekleurd met behulp van HLA-E tetrameren waaraan een TCR afgeleid peptide gebonden is dat een hoge affiniteit vertoont voor HLA-E. Enkel CD8+ T-cellen die specifiek binden met deze HLA-E/peptide complexen kunnen gedetecteerd worden. Met behulp van flow cytometrie kan dan nagegaan worden wat de frequentie is van deze cellen. Een zuivere HLA-E gerestricteerde CD8+ T-celpopulatie wordt uiteindelijk bekomen met behulp van high speed flow cell sorting (ism. het Virga Jesseziekenhuis, Hasselt). Een tweede techniek om HLA-E gerestricteerde CD8+ Tregs te bestuderen is een in vitro assay. CD8+ T-cellen worden hierbij gekweekt in aanwezigheid van bestraalde op voorhand geactiveerde myelin basic protein (MBP)-reactieve CD4+ T-cellen (stimulatorcellen) in een limiting dilution assay. De frequentie van HLA-E gerestricteerde CD8+ T-cellen wordt bepaald met behulp van de ex vivo assay (HLA-E tetrameren). Bovendien zullen we nagaan welke relevante merkers HLA-E gerestricteerde CD8+ T-cellen tot expressie brengen (fenotypering). Enerzijds zal de expressie van activatie (CD25, CD69, CTLA-4 en ICAM-1) en memory merkers (CD45RO) bestudeerd worden om na te gaan in welke mate deze cellen reeds in vivo geactiveerd zijn. Anderzijds wordt er aandacht besteed aan regulatoire merkers zoals Forkhead box P3 (FOXP3) en glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR). Een laatste stap in de karakterisatie van HLA-E gerestricteerde CD8+ T-cellen is de bepaling van het cytokineprofiel via een enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) of intracellulaire FACS kleuring. Een derde fase van het project omvat de studie van de suppressieve eigenschappen van de CD8+ regulatoire T-cellen. Om na te gaan of HLA-E gerestricteerde CD8+ T-cellen de proliferatie van CD4+ T-cellen kunnen onderdrukken zal een co-cultuur systeem gebruikt worden. In het onderzoek naar het mechanisme van regulatie bestuderen we drie aandachtspunten: 1) Worden autoreactieve T-cellen gelyseerd (cytotoxiciteit)? 2) Spelen cytokines een rol bij de onderdrukking van autoreactieve T-cellen? 3) Is de suppressie celcontact afhankelijk? Tot slot wordt een vergelijkende studie gemaakt van bovenstaande discussiepunten (frequentie, fenotype, cytokineprofiel en suppressie)tussen MS-patiënten en gezonde controles. Een éénduidige behandeling voor MS bestaat voorlopig nog niet. Huidige therapiën zijn er opgericht inflammatie en symptomen te onderdrukken. Er is echter nood aan meer specifiek behandelingen, zoals T-cel gerichte strategieën (T-celvaccinatie). Daarom worden in een volgend onderdeel van het project de effecten van IFN-bèta en T-celvaccinatie op de frequentie en functionele activiteit van de HLA-E gerestricteerde CD8+ regulatoire T-cellen onderzocht. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van het co-cultuur systeem in combinatie met de CFSE assay voor MS-patiënten voor en na behandeling. Vervolgens wordt de HLA-E expressie bestudeerd op de verschillende immunologische subtypes. Met behulp van Facs kleuring zal de HLA-E expressie nagegaan worden op monocyten, B-cellen en T-cellen voor en na activatie. Regulatoire HLA-E gerestricteerde CD8+ T-cellen onderdrukken mogelijk geactiveerde autoreactieve CD4+ T-cellen in de periferie. De vraag stelt zich of deze regulatoire T-cellen die rol ook op de plaats van ziekteactiviteit (lesies en CSF) uitoefenen. Om een idee te krijgen van het voorkomen van HLA-E gerestricteerde CD8+ T-cellen in het CSF, maken we opnieuw gebruik van de HLA-E tetrameren. In tweede instantie zal onderzocht worden of HLA-E gerestricteerde CD8+ T-cellen voorkomen in MS-lesies van MS-patiënten. Dit wordt indirect bestudeerd met behulp van immunofluorescente of histochemische dubbelkleuringen. Er wordt tot slot bestudeerd of in MS-lesies antigeen presenterende cellen voorkomen die HLA-E tot expressie brengen en mogelijk lokaal HLA-E gerestricteerde CD8+ regulatoire T-cellen kunnen activeren.

Periode

01 januari 2006 - 31 december 2009