Project R-2911

Titel

De ontwikkeling van een in vivo -systeem voor de plaatsspecifieke modificatie van proteïnen met 'click'-gefunctionaliseerde aminozuren voor de productie van innovatieve bio-actieve materialen.

Abstract

Het immobiliseren van proteïnen is van groot belang voor vele hedendaagse technologieën. Een goed voorbeeld hiervan is een biosensor. Een biosensor bestaat uit drie delen: een biologische receptor, en signaaloverbrengend platform en een dataverwerkingssysteem. Het cruciale deel van een biosensor is de aanwezigheid van een biologische receptor. Deze receptoren kunnen zeer specifieke doelmoleculen, aanwezig in de te analyseren oplossing, binden. Wanneer deze binding plaatsvindt, resulteert dit in een fysico-chemische verandering, dat door de transducer omgezet kan worden in een meetbaar signaal. Om een snelle en gevoelige detectie te verkrijgen, is het noodzakelijk dat de biomoleculen zodanig georiënteerd zijn op het oppervlak, dat het actieve deel van de molecule beschikbaar is voor het te detecteren molecule. Ook is het belangrijk dat er een stabiele verbinding gevormd is tussen de biomoleculen en het substraatoppervlak. Tot nu toe worden proteïnen vooral willekeurig gekoppeld op het oppervlak. Dit wil zeggen dat de actieve plaats van een fractie van de biomoleculen niet beschikbaar is, wat leidt tot een verminderde biologische activiteit. Voor een goede werking van een biosensor is het dus belangrijk dat de proteïnen covalent en volgens een welbepaalde oriëntatie gekoppeld worden op het oppervlak. De tot nu toe gebruikte strategieën kunnen dit niet leveren. Om bovenstaande problemen op te lossen zal in dit project een in vivo-methode ontwikkeld worden om gemodificeerde, bioorthogonale aminozuren plaatsspecifiek, als respons op het amber codon, in te bouwen in proteïnen. Dit zal in dit project gebeuren door het genetisch repertoire van de gist Saccharomyces cerevisiae uit te breiden. De incorporatie zal gebeuren door een mutant orthogonaal E.coli tyrosyl-tRNA synthetase (EcTyrRS)/tRNACUA paar, dat genetisch gecodeerd is. Hiervoor wordt een bibliotheek van mutante EcTyrRS aangemaakt en vervolgens gescreend op mutanten die specifiek het gemodificeerde aminozuur incorporeren. Het voordeel hiervan is dat proteïnen gesynthetiseerd kunnen worden die, op één strategisch gekozen plaats, een orthogonale functionele groep bezitten. In dit project wordt er gebruik gemaakt van Nanobodies als proteïnesysteem. Men moet rekening houden met de reactieomstandigheden van de covalente koppeling, aangezien proteïnen slechts in een bepaalde conformatie actief zijn, en deze verstoord kan worden door omgevingsfactoren zoals pH en temperatuur. Hierdoor is het aangewezen om onder milde omstandigheden deze plaatsspecifieke koppeling met het oppervlak te laten gebeuren. De oplossing hiervoor kan men samenvatten onder de noemer 'click'-chemie. De gemodificeerde proteïnen kunnen covalent gebonden worden aan een gefunctionaliseerd oppervlak m.b.v. een 'click' reactie. Deze reacties kunnen doorgaan in fysiologische omstandigheden en kamertemperatuur en zijn daarom zeer geschikt om proteïnen te koppelen op een oppervlak. De meest bekende 'click' reactie is de al dan niet kopergekatalyseerde Huisgen 1,3-dipolaire cycloadditie van alkyngroepen op azides. Door de niet natuurlijke aminozuren te modificeren met een alkyn of een azide, is het mogelijk om de proteïnen met behulp van deze reactie covalent te koppelen aan oppervlakken. Een manier om het gebruik van Cu(I) te omzeilen, is door het alkyn te activeren door ringspanning. Cyclooctynen reageren met aziden zonder gebruik van katalysatoren zoals koper. Door plaatsspecifiek een gemodificeerd aminozuur met een alkyn- of azidegroep in te bouwen heeft men dus de controle om de proteïnen volgens een bepaalde oriëntatie stabiel te koppelen, en zo een homogeen actief oppervlak te produceren. Dit project zal uitgevoerd worden in de onderzoeksgroep; Organische en Bio-polymere chemie (OBPC); waarin reeds één PhD en één post-doc actief zijn op het vlak van het covalent koppelen van biomoleculen aan vaste dragers.

Periode

01 maart 2011 - 28 februari 2012